PCR und qPCR

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren der Molekularbiologie und ermöglicht die schnelle Synthese vieler Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts. Die Methode wird unter anderem zur Amplifikation und Klonierung von Genen für Expressionsstudien, aber auch zur Detektion von Bakterien und Viren genutzt. In dieser Zusammenfassung geben wir Ihnen einen kurzen Überblick zur allgemeinen sowie zu verschiedenen Varianten der PCR.

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die vier Hauptbestandteile einer PCR sind:

• Primer
• DNA-Template
• thermostabile DNA-Polymerase
• Nukleotide (dNTPs)

Die Primer (forward und reverse) werden komplementär zu den Enden des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts erstellt, während das DNA-Template die Grundlage für die Reaktion bietet, da es den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt enthält. Die Polymerase synthetisiert Kopien des DNA-Abschnitts unter der Verwendung der Primer als Startpunkt und der Nukleotide. Die vervielfältigte DNA-Sequenz wird auch als Amplicon bezeichnet.

Standardmäßig gibt es bei einer PCR drei Phasen:

• Denaturierung
• Primerhybridisierung
• Elongation

Die Denaturierung erfolgt bei 95°C und spaltet die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen des DNA-Doppelstrangs, sodass daraus zwei DNA-Einzelstränge entstehen (Abb. 1.1). Die anschließende Primerhybridisierung erfolgt bei einer niedrigeren Temperatur zwischen 45 und 60°C. Dies hängt von der Länge und des GC-Gehalts der Primer ab. Die Primer binden komplementär an den zu amplifizierenden Abschnitt auf der einzelsträngigen DNA, wodurch ein kurzer Abschnitt doppelsträngiger DNA entsteht (Abb. 1. 2). In der letzten Phase, der Elongation, dient dieser Abschnitt als Startpunkt für die Synthese der komplementären Stränge durch die DNA-Polymerase. Die Elongation findet in der Regel bei 72 °C statt und der zu amplifizierende DNA-Abschnitt wird dabei in 5‘-3‘-Richtung synthetisiert (Abb. 1.3). Dieser Zyklus wiederholt sich etwa 20 bis 50 Mal [1]. Dabei werden die PCR-Produkte des ersten Zyklus als Ausgangsmaterial für den zweiten Zyklus (usw.) verwendet, was zu einer exponentiellen Amplifikation führt [2]. 

Abbildung 1: Ablauf der PCR. DNA-Template mit der zu amplifizierenden Sequenz (sequence of interest), dNTPs, Primern und DNA-Polymerase werden benötigt. Die Denaturierung (1) spaltet die dsDNA, woraufhin die Primer hybridisieren (2) und die Polymerase den komplementären Strang synthetisiert (3). Der Zyklus wird 20-50 Mal wiederholt. 

Der Nachweis, ob der gewünschte DNA-Abschnitt amplifiziert wurde, und die Analyse der PCR-Produkte erfolgen meist mittels einer Agarose-Gelelektrophorese. Hierbei wird geprüft, ob die synthetisierten DNA-Stücke die korrekte (erwartete) Basenpaarlänge haben. Die PCR-Produkte werden anschließend aufgereinigt und weiterverarbeitet (z.B. Klonierung, Sequenzierung).

Quantitative Polymerase-Ketten-Reaktion (qPCR)

Mit der qPCR, oder auch Echtzeit-PCR, ist es möglich, den Fortschritt der DNA-Amplifikation während des Prozesses zu überwachen. Die quantitative Bestimmung der Ausgangsmenge ist nützlich für die Analyse der Genexpression und die Bestimmung von DNA-Konzentrationen.

Das Verfahren der Amplifikation ist das gleiche wie zuvor beschrieben, allerdings werden bei der qPCR Fluoreszenzfarbstoffe oder Sonden in die Reaktion integriert (Abb. 2 und 3). Darüber hinaus wird ein Thermocycler mit einem optischen Detektionsmodul zur Messung des erzeugten Fluoreszenzsignals erfordert [3].

Bei der farbstoffbasierten qPCR entsteht die Fluoreszenz durch die Bindung eines Fluorophors an die kleine Furche der dsDNA, die während der Elongation entsteht (Abb. 2.3). Durch die nach jedem Zyklus gemessene Fluoreszenz kann die Menge der amplifizierten DNA abgeschätzt werden. Diese Option der Quantifizierung ist zwar kostengünstig, allerdings ist sie nicht spezifisch für die zu amplifizierende Ziel-DNA-Sequenz. Dadurch können Off-Target-Interkalationen stattfinden, die falsch interpretiert werden können. Mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse können die Fragmentlängen und somit auch die Spezifität der Messungen bestimmt werden [4].

Abbildung 2: Ablauf der farbstoffbasierten qPCR. Nach der Denaturierung (1) und Primerhybridisierung (2) interkaliert der Fluoreszenzfarbstoff in der dsDNA, die während der Elongation entsteht (3). 

Die sondenbasierte qPCR verwendet Fluoreszenzsonden, um spezifisch die Ziel-DNA-Sequenz nachzuweisen. Dabei binden Sonden, die mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff und einem Fluoreszenz-inhibierenden Quencher konjugiert sind, an eine DNA-Sequenz innerhalb des zu amplifizierenden Abschnitts (Abb. 3.2). Während der Elongation hydrolysiert die DNA-Polymerase die Sonde und der Fluoreszenz-Reporter wird abgespalten (Abb. 3.3). Durch die räumliche Distanz zum Quencher kann ein Fluoreszenzsignal gemessen werden, welches proportional zur Menge der erzeugten PCR-Produkte ist [3]. 

Abbildung 3: Ablauf der sondenbasierten qPCR. Nach der Denaturierung (1) hybridisieren sowohl die Primer als auch die Sonden mit einem Fluoreszenz-Reporter und einem Quencher, der die Fluoreszenz inhibiert (2). Bei der Elongation (3) wird der Reporter von der Sonde abgespalten, wodurch das Fluoreszenzsignal detektiert werden kann.

Reverse Transkriptase Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)

Bei der RT-PCR wird eine reverse Transkriptionsreaktion der PCR-basierten Amplifikation vorangestellt, um aus mRNA cDNA (complementary DNA) zu erzeugen. Eine RNA-Sequenz dient als Vorlage für die Reverse Transkriptase und die daraus resultierende einzelsträngige DNA dient wiederum als Vorlage für die PCR. Für die RT-PCR werden häufig Poly-dT-Primer verwendet, die an den Poly-A-Schwanz der mRNA binden. Die Schritte umfassen das Erhitzen der einzelsträngigen RNA, um die Sekundärstruktur aufzulösen, gefolgt von der Transkription der RNA in cDNA durch die Reverse Transkriptase. Die synthetisierte cDNA wird mittels des oben beschriebenen PCR-Verfahrens amplifiziert und zuletzt erfolgt die Analyse der PCR-Produkte [5].  

Die RT-qPCR ist eine Kombination aus den beschriebenen Methoden, bei der die RNA in cDNA transkribiert wird. Während der anschließenden cDNA-Amplifikation werden Farbstoffe bzw. Sonden verwendet, um eine quantitative Analyse in Echtzeit zu erreichen [6].

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Quellen

[1] https://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion (06.03.2024)

[2] Canene-Adams, K. (2013) „General PCR“, in Methods in Enzymology. Elsevier, S. 291–298.

[3] https://www.aatbio.com/catalog/real-time-pcr-qpcr (06.03.2024)

[4] https://de.wikipedia.org/wiki/Real_Time_Quantitative_PCR (12.03.2024)

[5] Bachman, J. (2013) „Reverse-Transcription PCR (RT-PCR)“, in Laboratory Methods in Enzymology: RNA. Elsevier, S. 67–74.

[6] https://www.medicoswab.com/de/what-are-the-differences-between-pcr-qpcr-and-rt-pcr/ (06.03.2024)