Optimierte qPCRs mit AAT Bioquest

Verfasst von Emily Locke

Diese Themen warten auf Sie:

1) Das Erfolgsrezept hinter der (q)PCR

2) Farbstoff-basierte vs. Sonden-basierte qPCR

3) Auswahl fluoreszierender Reporterfarbstoffe

4) Auswahl an Quencher-Farbstoffen

5) Empfohlene FRET-Paare für die Entwicklung von FRET-Oligonukleotiden

6) ROX – der wichtige Mitspieler im Hintergrund

7) AATs Mastermixe für bequemere qPCR-Assays

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In einer mondhellen Freitagnacht im April 1983 steigt Kary B. Mullis in sein Auto und begibt sich auf eine Fahrt durch die Berge Kaliforniens. Dass dieser Moment später einmal die gesamte Molekularbiologie revolutionieren würde, war ihm zu dem Zeitpunkt sicherlich noch nicht bewusst. Denn bei dieser nächtlichen Autofahrt kam Mullis die Idee für die Polymerase-Kettenreaktion, oder kurz PCR (polymerase chain reaction) – das heute wohl meistgenutzte molekularbiologische Verfahren überhaupt [1]. Für Forschende ist die PCR mittlerweile ein absolutes Standard-Werkzeug, doch spätestens seit der Corona-Pandemie kennt auch jeder Nicht-Wissenschaftler die Methode, mit der sich DNA schnell und günstig vervielfältigen lässt. Mullis bekam von seinem Arbeitgeber damals nur eine Prämie in Höhe von 10.000 US-Dollar, während die Rechte für die PCR kurz darauf für 300 Millionen US-Dollar an die Firma Roche verkauft wurden. Die verdiente Anerkennung für seine bahnbrechende Erfindung erhielt er schließlich 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie [2].

Mittlerweile haben sich viele verschiedene Varianten der PCR für unterschiedlichste Anwendungen etabliert. Eine der wichtigsten und meistgenutzten Verfahren neben der herkömmlichen PCR stellt dabei die quantitative Echtzeit-PCR (real-time quantitative PCR) oder kurz qPCR dar. Diese Weiterentwicklung der klassischen PCR ermöglicht neben der Vervielfältigung der DNA zusätzlich auch die Quantifizierung des amplifizierten Erbguts und findet beispielsweise Anwendung in Genexpressionsstudien, bei der Entdeckung von Biomarkern oder der Messung von RNA-Interferenz [3]. Damit Sie für Ihre zukünftigen qPCR-Experimente bestens ausgerüstet sind, versorgt Sie unser Hersteller AAT Bioquest aus Kalifornien (purer Zufall) mit hochwertigen bioanalytischen Reagenzien. Das Unternehmen ist ein Spezialist für Absorptions-, Fluoreszenz- und Lumineszenz-Technologien. Daher können Sie überall, wo Fluoreszenz und Lumineszenz genutzt werden, auf Produkte von AAT setzen – so auch bei Ihren qPCR-Experimenten. 

Das Erfolgsrezept hinter der (q)PCR

Doch zunächst erstmal ein großer Schritt zurück – wie genau funktioniert denn eine PCR eigentlich nochmal? Das Rezept für das erfolgreiche Verfahren ist im Prinzip recht simpel und besteht lediglich aus drei Schritten: Denaturierung, Primerhybridisierung und Elongation (Abb. 1). Im ersten Schritt wird das doppelsträngige DNA-Template (dsDNA) auf 95 °C erhitzt, wodurch die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren aufgebrochen und die DNA-Stränge getrennt werden (Denaturation, Abb. 1.1). An die nun einzelsträngige DNA können sich bei abgesenkter Temperatur im zweiten Schritt die Primer anlagern (Annealing, Abb. 1.2), wobei die genaue Annealing-Temperatur von der Länge und Sequenz der Primer abhängt. Die Primer binden an spezifische Regionen innerhalb des DNA-Templates, sodass nur eine bestimmte Sequenz (sequence of interest) amplifiziert wird. Diese Vervielfältigung wird durch die DNA-Polymerase erreicht, die ausgehend vom 3‘-Ende des angelagerten Primers den neuen Strang komplementär zum einzelsträngigen DNA-Template synthetisiert (Extension, Abb. 1.3). Solch ein Zyklus wird während einer PCR etwa 20 bis 50 Mal wiederholt, was zu einer exponentiellen Amplifikation der gewünschten Zielsequenz führt [4].

Abbildung 1: Ablauf einer Polymerase-Kettenreaktion. Zu dem DNA-Template, das die zu amplifizierende Sequenz enthält, werden dNTPs, spezifische Primer und eine DNA-Polymerase gegeben. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA erhitzt und somit in einzelne Stränge getrennt (1). Danach folgt die Anlagerung der Primer (2) und die Verlängerung durch die Polymerase (3). Die Zyklen werden 20 bis 50 Mal wiederholt, wodurch es zu einer exponentiellen Vervielfältigung der Zielsequenz kommt [5].

Das Prinzip hinter der Vervielfältigung der DNA ist bei einer qPCR analog zu dem einer konventionellen PCR. Der große Unterschied zwischen den beiden Varianten besteht darin, dass die qPCR die Quantifizierung der amplifizierten DNA mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen ermöglicht, die während eines PCR-Zyklus‘ in Echtzeit erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt dabei proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu und wird während des gesamten PCR-Laufs von einem Thermocycler überwacht [3]. Indem die Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Zyklusnummer aufgetragen wird, können qPCR-Geräte sogenannte Amplifikationsplots generieren, welche die Anreicherung von Amplikons während des gesamten PCR-Laufs darstellen (Abb. 2). Der sogenannte Ct-Wert (cycle threshold) oder Cp-Wert (crossing point) beschreibt den Zyklus, an dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt. Oftmals wird ein Haushaltsgen als interne Kontrolle verwendet, um eine relative Quantifizierung nach der ΔΔCt-Methode durchzuführen. Hierzu werden die Ct-Werte von Zielgen und Referenz voneinander abgezogen und anschließend die Differenz zwischen den ΔCt-Werten der einzelnen Gruppen gebildet. Durch einsetzen in die Formel 2^-ΔΔCt erhält man die relative Genexpression zur Referenz [6].

Abbildung 2: Typischer Amplifikationsplot einer qPCR. Der Graph zeigt die Anreicherung von Amplikons während eines PCR-Laufs. Die Zielsequenz in diesem Beispiel war GAPDH, wobei verschiedene Mengen an cDNA eingesetzt wurden (zwischen 100 ng und 0,00001 ng). Zur Detektion der PCR-Produkte wurde AATs Helixyte^TM Green *20X Aqueous PCR Solution* genutzt [3].

Farbstoff-basierte vs. Sonden-basierte qPCR – zwei Methoden im Vergleich

Und woher kommt die Fluoreszenz? Allgemein gibt es bei qPCRs zwei verschiedene Strategien, welche die Bestimmung der DNA-Mengen ermöglichen: die Farbstoff-basierten (Abb. 3) und die Sonden-basierten (Abb. 4) qPCRs [3]. Bei der Farbstoff-basierten Methode wird ein Fluorophor eingesetzt, der sich in die DNA einlagert, indem er an die kleine Furche der dsDNA bindet (Abb. 3.3). Der Farbstoff zeigt eine schwache Hintergrundfluoreszenz, deren Intensität durch die Bindung an die dsDNA signifikant ansteigt. Durch die Amplifikation der Zielsequenz entstehen mehr Bindungsstellen für den Farbstoff, weshalb die Zunahme der Fluoreszenz direkt mit der Menge der vorhandenen dsDNA korreliert [7].

Abbildung 3: Prinzip der Farbstoff-basierten qPCR. Nach der Denaturierung (1) und der Anlagerung der Primer (2) folgt die Verlängerung der Zielsequenz durch die DNA-Polymerase (3). Der interkalierende Farbstoff bindet an die kleine Furche der neu entstandenen dsDNA. Eine Zunahme der DNA-Menge während der PCR führt daher zu einem Anstieg der bei jedem Zyklus gemessenen Fluoreszenzintensität [3].

Bei der Farbstoff-basierten Methode werden nur zwei Sequenz-spezifische Primer benötigt, daher ist diese Variante die schnellste und kostengünstigste Option für eine qPCR. Allerdings ist die Interkalation des Farbstoffes nicht auf die Zielsequenz begrenzt, wodurch auch unerwünschte Produkte und Primer-Dimere nachgewiesen werden können, was wiederum eine ungenaue Quantifizierung zur Folge haben kann. Um sicherzustellen, dass nur das gewünschte Ziel amplifiziert wurde, erstellt man daher in der Regel nach jedem Experiment eine Schmelz-Kurve, mit welcher man die Genauigkeit der Reaktion bestimmen kann. Mit der Farbstoff-basierten Methode kann darüber hinaus nur jeweils eine Zielsequenz quantifiziert werden, Multiplexing-Messungen sind nicht möglich [7].  

Die Ungenauigkeit des Farbstoffes und die Limitierung auf ein Zielgen können mit einer Sonden-basierten qPCR überwunden werden (Abb. 4). Hierbei wird die Fluoreszenz einer Fluorophor-markierten, Sequenz-spezifischen Sonde in Echtzeit gemessen. Die Designs der Sonden können dabei stark variieren, wobei sogenannte Hydrolyse-Sonden am gebräuchlichsten sind. Hierbei handelt es sich um kurze Oligonukleotide, deren Sequenz komplementär zur Zielsequenz ist und die mit einem 5‘-Reporter-Fluorophor sowie einem 3‘-Quencher markiert sind. Solange die Oligosonde intakt ist, emittiert sie lediglich eine geringe Fluoreszenz, da der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Reporter und Quencher die Emission des Fluorophors verhindert (Abb. 4.2).

Abbildung 4: Prinzip der Sonden-basierten qPCR. Nach der Denaturierung (1) und der Anlagerung der Primer (2) folgt die Verlängerung der Zielsequenz durch die DNA-Polymerase (3). Während der Synthese des Gegenstranges wird die Sonde am 5‘-Ende abgebaut, wodurch sich Quencher und Fluorophor voneinander entfernen. Die daraus resultierende, steigende Reporter-Fluoreszenz kann am Ende der Elongation in jedem Zyklus gemessen werden [3].

Da die in der PCR eingesetzte DNA-Polymerase zusätzlich eine Endonuklease-Domäne hat, wird die Sonde bei der Amplifikation der Zielsequenz durch diese Domäne hydrolysiert und der Fluoreszenz-Reporter vom Oligonukleotid abgespalten [8]. Dadurch kommt es zur räumlichen Trennung des Reporter-Fluorophors vom Quencher, was eine Amplifikations-abhängige Erhöhung der Fluoreszenz zur Folge hat (Abb. 4.3). Die Sonden-basierte Strategie ist oft die bevorzugte Technologie für diagnostische Anwendungen, da sie typischerweise spezifischer als Farbstoff-basierte qPCRs ist. Darüber hinaus sind Multiplexing-Messungen durch die Verwendung eines anderen Fluorophors für jedes Target möglich. Jedoch ist diese Methode im Vergleich zur Farbstoff-basierten Technologie sehr viel teurer und aufwändiger [7].

*weitere verfübare Varianten: acid, alkyne, amine, azide, maleimide

*weitere verfübare Varianten: acid, alkyne, amine, azide, maleimide

ROX – der wichtige Mitspieler im Hintergrund

Neben den bereits genannten Reagenzien (DNA-Template, Sequenz-spezifische Primer, DNA-Polymerase, interkalierender Farbstoff oder Sonde) gibt es noch eine weitere essentielle Komponente, die in Ihrem qPCR-Mastermix nicht fehlen sollte: der passive Referenzfarbstoff ROX bzw. Carboxy-X-Rhodamin [9]. Dieser Fluorophor wird eingesetzt, um die Intensität des Fluoreszenzsignals des Reporterfarbstoffs zu normalisieren. Dadurch wird es möglich, nicht-PCR-basierte Variationen im Fluoreszenzsignal, wie beispielsweise Pipettierfehler, Luftblasen, Kondensierung oder Drift von Geräteparametern, auszugleichen [10]. Da ROX nicht mit der qPCR-Reaktion interferiert und ein leicht erkennbares, rotes Emissionsspektrum besitzt, bietet es eine exzellente Baseline in Multiplex-qPCR-Assays. Der Referenzfarbstoff trägt somit entscheidend zur Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von qPCRs bei und wird daher in vielen Laboren genutzt [3].

Trotz seiner vielfältigen Anwendung bringt ROX den ein oder anderen Nachteil mit sich: Der Referenzfarbstoff zeigt lediglich eine geringe Stabilität und muss außerdem kalt gelagert werden, um seine Fluoreszenz zu erhalten. Daher hat unser Partner AAT Bioquest einen neuen Referenzstoff entwickelt: 6-ROXtra™ zeigt eine erhöhte Stabilität sowie verbesserte Wasserlöslichkeit verglichen zum herkömmlichen ROX und besitzt trotzdem ähnliche spektrale Eigenschaften [3]. 

AATs Mastermixe für bequemere qPCR-Assays

Alle Forschenden, die schon mal eine qPCR durchgeführt haben, kennen den damit verbundenen Aufwand. Dieser ist besonders hoch, wenn man viele verschiedene Proben testen möchte. Doch keine Sorge – AAT hat auch hierfür eine geeignete Lösung parat und versorgt Sie mit bequemen, vorgemischten Cocktails, die alle benötigten Komponenten für eine qPCR enthalten (ausgenommen Template, Primer und gegebenenfalls Sonden). Die TAQuest™ Master-Mixe vereinfachen das Set-Up ohne die Sensitivität, Spezifität oder PCR-Effizienz zu beeinträchtigen. Die Mixturen enthalten eine TAQuest™ Hot Start Taq DNA-Polymerase, die den Ansatz der Reaktion bei Raumtemperatur ermöglicht, sowie dNTPs, MgCl₂ und Stabilisatoren in einem optimierten Reaktionspuffer. Außerdem sind Mischungen mit Helixyte™ Green verfügbar, einem DNA-interkalierenden Farbstoff, der die Detektion der PCR-Produkte während der Amplifikation ermöglicht (s. Abb. 2). Darüber hinaus können Sie Mixe mit einem ROX-Referenzfarbstoff für eine erhöhte Datenpräzision sowie für Unterstützung beim Troubleshooting wählen [3].

Neugierig auf mehr Produkte unseres Fluoreszenz-Spezialisten? Hier finden Sie das gesamte Portfolio von AAT Bioquest. Und wenn Sie schon am Stöbern sind: Nutzen Sie unseren Rabatt von 10% auf alle Labeling-Kits von AAT!

Quellen

[1] Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Scientific American. 262(4), 56-65 (1990).

[2] https://www.haematopathologie-hamburg.de/methoden/pcr-qpcr/, 03.06.2023.

[3] https://www.aatbio.com/catalog/real-time-pcr-qpcr, 03.06.2023.

[4] https://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion, 03.06.2023.

[5] https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction-en.svg, 03.06.2023.

[6] https://de.wikipedia.org/wiki/Real_Time_Quantitative_PCR, 03.06.2023.

[7] https://www.neb-online.de/pcr-dna-amplifikation/qpcr-real-time-pcr-und-rt-qpcr/, 03.06.2023.

[8] https://portlandpress.com/biochemist/article/42/3/48/225280/A-beginner-s-guide-to-RT-PCR-qPCR-and-RT-qPCR, 03.06.2023.

[9] https://www.genaxxon.com/shop-all-products/chemikalien/fluoreszenzmarker/3798/5/6-rox-isomerengemisch-100-mg-s5411.0100, 03.06.2023.

[10] https://de.lumiprobe.com/p/rox-reference-dye, 03.06.2023.

Preview-Bild: https://unsplash.com/de/fotos/pwcKF7L4-no