Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ermöglicht die automatisierte Untersuchung der physikalischen und molekularen Eigenschaften von Zellen durch den Einsatz von Laserlicht [1]. Das Gerät zur Durchführung dieser Analyse nennt man Durchflusszytometer. Eine Erweiterung stellt die sogenannte FACS-Methode dar („Fluorescence-activated Cell Sorting“), bei der die Zellen nicht nur gemessen, sondern aufgrund ihrer Fluoreszenz-Markierung auch in unterschiedliche Reagenzgefäße sortiert werden [2].

Das Prinzip der Durchflusszytometrie basiert auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion, für welche Fluoreszenzfarbstoff-markierte Antikörper eingesetzt werden, oder der direkten Anfärbung von Zellen mit Farbstoffen. Die Zellen fließen dazu zunächst einzeln durch hydrodynamische Fokussierung in eine Messkammer, die sogenannte „Flow Cell“ [2]. Hier werden sie von einem Laserstrahl bestimmter Wellenlänge angestrahlt, wodurch die Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffs auf ein höheres Energieniveau gehoben werden. Die Elektronen fallen dann unter Abgabe von Photonen wieder auf ihr Ursprungsniveau zurück. Ein Photodetektor wertet das entstehende Streulicht oder Fluoreszenzsignal aus, welches sich proportional zu der Zellmenge verhält. Da jeder Zelltyp ein charakteristisches Streulicht erzeugt, können darüber auch Aussagen zur Größe und Binnenstruktur der Zellen gemacht werden [3]. Ein FACS-Gerät besitzt zusätzlich zu den Detektoren einen elektrostatischen Sortiermechanismus. Hierbei wird eine Elektrode eingesetzt, die einen Tropfen aus dem Probenstrahl bei einer zu sortierenden Zelle umgekehrt polarisiert. Durch ein nachgeschaltetes elektrisches Feld wird die Zelle so abgelenkt, dass sie in ein anderes Gefäß fällt als nicht zu sortierende Zellen [4].

Prinzip des Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS). Das Durchflusszytometer wird mit der Probe beladen. In der Messkammer werden die Zellen mit einem Laserstrahl bestrahlt. Hier misst ein Detektor das Vorwärtsstreulicht (FSC: Forward Scatter), welches von der Zellgröße abhängt, sowie das Seitwärtsstreulicht (SSC: Side Scatter), welches von der Granularität der Zelle beeinflusst wird. Die Tröpfchen des Probenstrahls werden durch eine Elektrode polarisiert und mit Hilfe eines elektrischen Feldes entsprechend ihrer Ladung sortiert (Abbildung mit biorender.com erstellt).

Das optische Prinzip eines Durchflusszytometers ähnelt zwar stark dem eines Fluoreszenz-Mikroskops, jedoch können in ersterem 50.000 bis 100.000 Zellen in wenigen Sekunden vermessen werden, während ein Fluoreszenz-Mikroskop nicht zu so einem High-Throughput-Screening in der Lage ist. Darüber hinaus ist bei der Durchflusszytometrie die Messung in Echtzeit möglich. Die erhaltenen Daten werden üblicherweise in Histogrammen oder Dotplots dargestellt [4].

Anwendung findet die Durchflusszytometrie vor allem in der medizinischen und zellbiologischen Grundlagenforschung. In der Klinik kann die Methode in Bereichen der Hämatologie, Infektiologie und Immunologie eingesetzt werden, während sie in der Biologie eher für die qualitative und quantitative Untersuchung von Zellen genutzt wird. Die Methode ermöglicht die Analyse von Zellfunktionen sowie eine Unterscheidung zwischen beispielsweise lebenden und toten Zellen [4]. Darüber hinaus setzt man Durchflusszytometrie in der Lebensmittelanalytik für die Bestimmung der Keimzahl in Rohmilch ein [5].

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Quellen

[1] Picot, J., Guerin, C.L., Le Van Kim, C. et al. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64, 109–130 (2012).

[2] https://flexikon.doccheck.com/de/Durchflusszytometrie, 24.01.2023

[3] https://www.unimedizin-mainz.de/facs/durchflusszytometrie/prinzip-der-durchflusszytometrie.html, 24.01.2023

[4] https://de.wikipedia.org/wiki/Durchflusszytometrie, 24.01.2023

[5] Amtliche Sammlung von Untersuchungsmethoden gemäß § 64 LFGB: L 01.01-7:2002-05 Untersuchung von Lebensmitteln – Bestimmung der Keimzahl in Rohmilch – Durchflusszytometrische Zählung von Mikroorganismen (Routineverfahren). Beuth Verlag (2002).