SDS-PAGE und Western Blot

Beim Western Blot handelt es sich um ein bewährtes, molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis, zur Analyse und zur Quantifizierung von Proteinen [1]. Dies geschieht durch das Übertragen, das sogenannte „Blotting“, auf eine Trägermembran [2]. Anschließend können Proteine durch eine Immundetektion visualisiert werden [3]. Der Name ist angelehnt an den Southern Blot. Edwin Southern, der als Erfinder der Blotting-Technik gilt, hat 1975 das erste Blotverfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten entwickelt. Als Namensspiel erhielt dann der Nachweis von RNA den Namen Northern Blot, während der Nachweis für Proteine Western Blot genannt wurde. Weitere Methoden sind der Southwestern Blot zum Nachweis von DNA-Protein-Interaktionen und der Northwestern Blot zum Nachweis von RNA-Protein-Interaktionen [2].

Arbeitsablauf beim Western Blotting. Im ersten Schritt wird das zu untersuchende Proteinlysat durch eine Gelelektrophorese aufgetrennt (1). Daraufhin werden die Proteine auf eine Membran übertragen (2) und über eine Immundetektion nachgewiesen. Dabei bindet ein Primärantikörper an das gesuchte Protein und ein Enzym-gekoppelter Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper. Nach Zugabe des entsprechenden Substrats kann ein Signal detektiert werden (3) und die Proteine werden als Banden auf der Membran visualisiert (4) (Abbildung mit biorender.com erstellt).

Bevor der eigentliche Western Blot durchgeführt werden kann, muss das zu untersuchende Proteinlysat zunächst aufgetrennt werden. Dies kann durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden, zum Beispiel mittels einer SDS-PAGE, einer nativen PAGE, isoelektrischer Fokussierung oder einer 2D-Gelelektrophorese. Je nach gewählter Methode werden die Proteine anhand ihrer Größe, ihrer Ladung oder ihrer räumlichen Struktur aufgetrennt [2]. Bei der SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) beispielsweise erfolgt die Auftrennung nach der Molekülgröße: Hierbei wird das Probenmaterial mit Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) versetzt, welches sich an die Proteine lagert und sie dadurch denaturiert. So erhalten sie eine stark negative Ladung, was ihre Eigenladung überdeckt. Da die negative Ladung proportional zu Masse des Proteins ist, hängt seine Wanderungsgeschwindigkeit im Gel nur noch von seiner Molekülgröße ab [4]. 

Im nächsten Schritt werden die aufgetrennten Proteine mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, welches senkrecht zum Gel steht, auf eine Polyvinylidendifluorid- (PVDF) oder Nitrocellulose-Membran übertragen. Die nun fest auf der Membran gebundenen Proteinbanden können mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesen werden, wobei am häufigsten die Immundetektion gewählt wird. Dazu werden zunächst die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert. Dies geschieht durch das Aufbringen von Proteinen, die nicht von den verwendeten Antikörpern erkannt werden können. Häufig wird die Membran mit bovinem Serumalbumin, Milchpulver-Lösung oder Gelatine behandelt. Nach dem Blockierungsschritt werden spezifische mono- oder polyklonale Primärantikörper auf die Membran gegeben, welche an das gesuchte Protein binden. Im Anschluss kommen Enzym-gekoppelte (z.B. HRP) Sekundärantikörper zum Einsatz und binden an die Primärantikörper. Nach mehrfachem Waschen zur Entfernung überschüssiger Antikörper wird ein Substrat hinzugegeben, welches von dem Enzym umgesetzt wird und die Detektion des untersuchten Proteins ermöglicht [5].

Der Western Blot gehört zu den meistverwendeten Methoden zur Analyse von Proteinen [6]. Er findet sowohl in der biochemischen und medizinischen Forschung als auch in der Diagnostik Anwendung. Häufig wird er zum Nachweis krankheitsrelevanter Proteine genutzt, insbesondere zur Detektion spezifischer Antikörper im Blutserum für die Diagnose von Infektionen. Das beim Blotting entstehende Bandenmuster kann Hinweise auf den Infektionszeitpunkt geben und helfen, zwischen verschiedenen Erregern zu unterscheiden [4]. Der Western Blot kann aber auch für semiquantitative Analysen oder zum qualitativen Nachweis von Protein-Veränderungen, wie beispielsweise posttranslationalen Modifikationen, genutzt werden [1].

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Quellen

[1] https://www.uniklinikum-saarland.de/de/einrichtungen/fachrichtungen/zellbiologie/seminar_zellbiologie_20192020/blots/anwendungsbeispiele, 10.06.2023

[2] https://de.wikipedia.org/wiki/Western_Blot, 24.01.2023

[3] A. M. Gressner, O. A. Gressner: Western blot. In: Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Berlin Heidelberg. S. 2505–2506 (2019).

[4] https://flexikon.doccheck.com/de/SDS-PAGE, 30.01.2023

[5] https://flexikon.doccheck.com/de/Western_Blot, 24.01.2023

[6] C. P. Moritz. 40 years Western blotting: A scientific birthday toast. Journal of Proteomics (2020).