Fluoreszenzmikroskopie
Während die Lichtmikroskopie auf der Reflexion und Absorption von Licht am Objekt basiert, beruht die Fluoreszenzmikroskopie auf der Anregung bestimmter Substanzen und der Detektion des dadurch emittierten Lichts. In den Biowissenschaften wird die Fluoreszenzmikroskopie beispielsweise zur Untersuchung von Proteinlokalisationen, zur Analyse von physiologischen Zellzuständen (z.B. pH-Wert, Calcium-Level oder Redox-Potentiale) oder für die Visualisierung bestimmter Zellorganellen eingesetzt [1].
Wie kommt es zu Fluoreszenz?
Der Begriff Fluoreszenz wurde bereits 1852 von Sir George Gabriel Stokes geprägt, der entdeckte, dass ultraviolette Anteile des Sonnenlichts das Leuchten verschiedener Substanzen erzeugen können und dass die anregenden Wellenlängen immer kürzer sind als die emittierten [2]. Auf Atomebene nehmen Elektronen die Lichtenergie der Photonen auf und gelangen dabei auf ein höheres Energieniveau. Dieser angeregte Zustand der Elektronen ist allerdings instabil und die Elektronen kehren innerhalb von Nanosekunden wieder in den Grundzustand zurück. Die Energie der Elektronen kann dabei auf verschiedene Wege abgegeben werden: Der Hauptteil der Energie wird erneut über Photonen abgegeben, wodurch es zur Emission von Fluoreszenz kommt. Andere Teile der Anregungsenergie werden jedoch ohne Strahlung auf benachbarte Moleküle übertragen, oder durch Übergänge verschiedener Schwingungszustände der Elektronen verbraucht. Dadurch kommt es zum Energieverlust der emittierten Photonen im Vergleich zu den anregenden Photonen und folglich auch zu einer höheren Wellenlänge. Diese Veränderung der Wellenlänge des Lichts wird nach seinem Entdecker auch als „Stokes Shift“ bezeichnet (Abb. 1) [3, 4].
Abbildung 1: Darstellung von Elektronenübergängen im Molekül in einem sog. Jablonski-Diagramm. Nach Absorption der Energie eines Photons gehen Elektronen aus dem Grundzustand S0 in einen Anregungszustand (S1 oder S2) über. Variationen der Energieniveaus entstehen durch Schwingungen im Atom (kurze graue Striche) oder durch Wechselwirkungen mit benachbarten Molekülen (längere Striche). Angeregte Elektronen können Energie durch diese Bewegungen im und um das Molekül oder als thermische Energie abgeben (gewellter Pfeil). Der Rest der Anregungsenergie wird in Form von Photonen freigesetzt, die durch kleine Energieabweichungen ein Fluoreszenzspektrum erzeugen [4, 5] (Abbildung modifiziert nach [5]).
Wie ist ein Fluoreszenzmikroskop aufgebaut?
Grundsätzlich enthält ein Fluoreszenzmikroskop die gleichen Bestandteile wie ein Lichtmikroskop. Allerdings befindet sich die Lichtquelle – im Gegensatz zum Lichtmikroskop – bei den meisten Fluoreszenzmikroskopen über dem Objekt [5]. Um das Objekt mit Licht zu bestrahlen und gleichzeitig erzeugtes Licht zu detektieren, macht man sich den Stokes Shift zunutze: Durch den Unterschied der anregenden und emittierten Wellenlänge kann das in das Mikroskop einfallende Licht mit einem sogenannten dichroitischen Spiegel gefiltert werden (Abb. 2), dessen Oberfläche bei Lichteinfall abhängig von der Wellenlänge zu verschiedenen Ablenkungen der Lichtwellen führt. Dadurch wird das anregende, kurzwellige Licht von einer seitlich liegenden Lichtquelle an ihm gespiegelt und nach unten durch das Objektiv geleitet, während das vom Objekt emittierte, längerwellige Licht den Spiegel passieren kann und so gerade nach oben zum Okular gelangt.
Zusätzliche Interferenzfilter im Mikroskop begrenzen die anregende und detektierte Wellenlänge weiterhin und ermöglichen eine genaue Detektion des Signals (Abb. 2) [4, 5]. Weitere Bauteile kommen bei speziellen Fluoreszenzmikroskopieverfahren zum Einsatz, wie z.B. der Konfokalmikroskopie. Bei dieser Methode befinden sich Lochblenden im Objektiv, die dazu führen, dass nur ein kleiner Bereich des Präparats beleuchtet wird und gleichzeitig auch nur das emittierte Licht dieser fokussierten Stelle den Detektor erreicht. Das eintreffende Signal wird verstärkt und die erhaltenen Bilder der einzelnen Objektbereiche mithilfe von Computerprogrammen zusammengesetzt. Durch diese Fokussierung auf eine bestimmte Ebene im Objekt kann das Präparat in Schichten „durchleuchtet“ werden, während gleichzeitig ein hoher Kontrast erzielt und die Hintergrundfluoreszenz minimiert wird [5].
Abbildung 2: Aufbau des Filterblocks in einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop. Ein Exzitationsfilter lässt nur Licht geeigneter Wellenlänge von der Lichtquelle passieren. Am dichroitischen Spiegel wird das hochenergetische, kurzwellige Licht gebrochen, nach unten auf das Objekt geworfen und dieses angeregt. Die emittierte Fluoreszenz gelangt erneut zum dichroitischen Spiegel, wo es allerdings durch seine höhere Wellenlänge den Spiegel direkt durchtreten kann. Um unspezifische Signale zu vermeiden, wird das Fluoreszenzspektrum mithilfe eines Emissionsfilters reduziert und gelangt schließlich zu einem Detektor oder direkt zum Okular [4, 5] (Abbildung modifiziert nach [5]).
Wie können Zielmoleküle mit Fluoreszenz nachgewiesen werden?
Da Proteine (meistens) nicht von alleine Licht emittieren, werden in der Fluoreszenzmikroskopie spezifische Marker verwendet, mit deren Hilfe die Detektion der Zielmoleküle möglich ist. Die verwendeten Substanzen können dabei in direkte und indirekte Fluoreszenzfarbstoffe eingeteilt werden (Abb. 3): Erstere interagieren dabei direkt mit dem Zielmolekül, wie z.B. DAPI oder Hoechst, die beide in der kleinen Furche der DNA interkalieren und so den Zellkern markieren [1, 5]. Indirekte Farbstoffe dagegen werden an einen Bindungspartner der Zielmoleküle gekoppelt. Beispielsweise wird für den Nachweis von Aktinfilamenten der Interaktionspartner Phalloidin an einen fluoreszierenden Farbstoff wie Rhodamin oder FITC gebunden [5, 6]. Außerdem gehören zu den indirekten Farbstoffen auch Fluorochrom-gekoppelte Antikörper, die an das Zielmolekül binden (Abb. 3).
Abbildung 3: Übersicht über mögliche Fluoreszenzquellen bei der Fluoreszenzmikroskopie. Zur Analyse von Vorgängen in Zellen und Geweben kommen bereits vorhandene, fluoreszierende Proteine infrage (Auto- oder Primärfluoreszenz) oder künstlich in den Organismus eingebrachte Fluoreszenzquellen (Sekundärfluoreszenz). Zu letzterer Gruppe gehören sowohl direkte, am Zielmolekül bindende, als auch indirekt über Bindungspartner wirkende Fluoreszenzfarbstoffe. Vor allem für in vivo-Versuche sind auch rekombinante Proteine interessant, die durch genetische Modifikation erzeugt werden. Besonders bekannt ist dabei das Green Fluorescent Protein, kurz GFP [5]. Icons von www.flaticon.com (Autoren: Zellen - Freepik, Antikörper - AbtoCreative).
Bei beiden Arten von Fluoreszenzfarbstoffen muss allerdings darauf geachtet werden, ob diese in einem fixierten Präparat oder in einem in vivo-Experiment genutzt werden: DAPI kann nur fixierte Zellmembranen durchdringen, während andere Farbstoffe nach Fixierung verblassen oder nur durch aktiven Transport ins Zellinnere aufgenommen werden können [5]. Für in vivo-Versuche besonders interessant sind außerdem rekombinante Proteine, die gentechnisch durch das Einbringen der DNA-Sequenz fluoreszierender Proteine wie GFP erzeugt werden. Sie ermöglichen es, die physiologische Expression und die Lokalisation der Genprodukte im zeitlichen Verlauf nachzuverfolgen [1, 5].
Während die bisher genannten Möglichkeiten Fluoreszenz künstlich in den Organismus einbringen – sogenannte sekundäre Fluoreszenz – gibt es auch eine Reihe von endogenen fluoreszierenden Molekülen wie zum Beispiel Chlorophyll. Beim Nachweis anderer Zielmoleküle kann diese Primär- oder Autofluoreszenz (Abb. 3) jedoch auch spezifische Signale überdecken. Wichtig ist daher der Vergleich mit ungefärbten Kontrollen und gegebenenfalls eine vorherige Behandlung mit Reagenzien wie Sudanschwarz, die Hintergrundfluoreszenzen unterdrücken [1, 5, 7].
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Quellen
[1] T. Bihonegn, „Fluorescence Microscope: A Review Article,“ Journal of Medicine, Physiology and Biophysics, pp. 18-25, o.D. Mai 2018.
[2] B. Valeur und M. N. Berberan-Santos, „A Brief History of Fluorescence and Phosphorescence before the Emergence of Quantum Theory,“ Journal of Chemical Education, pp. 731-738, 18 März 2011.
[3] Carl Zeiss Microscopy GmbH, „Principles of Fluorescence and Fluorescence Microscopy,“ o.D. Mai 2019. [Online]. Available: https://pages.zeiss.com/rs/896-XMS-794/images/ZEISS-Microscopy_Technology-Note_Principles-of-Fluorescence.pdf. 28 Juni 2023.
[4] J. W. Lichtmann und J.-A. Conchello, „Fluorescence microscopy,“ Nature methods, pp. 910-919, 18 November 2005.
[5] S. Schmitz und C. Desel, „Fluoreszenzmikroskopie,“ in Der Experimentator Zellbiologie, Berlin, Heidelberg, Springer Spektrum, 2018, pp. 81-109.
[6] Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH, „Lexikon der Biologie: Immunfluoreszenz,“ [Online]. Available: https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/immunfluoreszenz/33800.14. September 2023.