Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist ein immunologisches Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen oder Antikörpern [1]. Die nachzuweisende Substanz wird zunächst über einen Primärantikörper an eine Mikrotiterplatte gebunden, dann führt ein sogenannter Enzym-gekoppelter Detektionsantikörper zu einer Farbreaktion [2]. Die Quantifizierung des Signals erfolgt durch die Messung der optischen Dichte in einem Photometer bei entsprechender Wellenlänge [1]. Der ELISA löst den für lange Zeit verwendeten Radioimmunassay ab, bei welchem radioaktives Material für die Detektion eingesetzt wird [3]. Im Folgenden wird ein kurzer Überblick über die verschiedenen ELISA-Methoden gegeben.
Überblick über unterschiedliche ELISA-Methoden. Beim direkten ELISA wird ein Enzym (rote Kugel)-gekoppelter Primärantikörper eingesetzt, der an das Antigen (blaue Kugel) bindet. Im indirekten ELISA wird zusätzlich zu einem Primärantikörper ein markierter Sekundärantikörper verwendet. Im Falle des Sandwich-ELISAs wird das Antigen von zwei Antikörpern umgeben, wobei ein zweiter sekundärer Antikörper zum Einsatz kommt, an den ein Enzym gekoppelt ist. Beim kompetitiven ELISA konkurriert markiertes Antigen (orangene Kugel) mit unmarkiertem Antigen aus der Probe um die Bindestellen am Detektionsantikörper, wodurch ein umgekehrt proportionales Verhältnis zwischen Signalstärke und Konzentration des gesuchten Antigens entsteht. In jedem Fall setzt das gekoppelte Enzym ein bestimmtes Substrat um, wodurch ein detektierbares Signal erzeugt wird (Abbildung mit biorender.com erstellt).
Direkter ELISA
Beim direkten ELISA wird eine Mikrotiterplatte mit dem nachzuweisenden Antigen beschichtet. Danach wird ein Enzym-gekoppelter Primärantikörper hinzugegeben, welcher das Antigen bindet. Im Anschluss wird ein Substrat hinzugefügt, welches von dem Enzym umgesetzt wird, wodurch ein detektierbares Signal erzeugt wird [4]. Der direkte ELISA kommt oft in serologischen, diagnostischen Testsystemen zum Einsatz, um gegen ein Pathogen-Antigen gerichtete Antikörper als Hinweis auf eine Infektion zu detektieren. Die Methode zeichnet sich durch eine schnelle Durchführung aus, da nur ein Antikörper angewendet werden muss. Andererseits ist diese Methode in der Produktion recht zeitaufwändig und teuer, weil für jedes nachzuweisende Antigen ein passender Antikörper markiert werden muss [1]. Dieser Nachteil wird im indirekten ELISA umgangen.
Indirekter ELISA
Auch beim indirekten ELISA erfolgt zunächst die Immobilisierung des Antigens durch direkte Adsorption an die Mikrotiterplatte. Der an das Antigen bindende Primärantikörper ist aber in diesem Fall nicht markiert. Stattdessen wird ein Enzym-gekoppelter Sekundärantikörper eingesetzt, welcher an den primären Antikörper bindet und durch Umsetzung eines Substrates zu einer Farbreaktion führt. Bei dieser ELISA-Methode kann es zu einer Signalverstärkung kommen, da jeder Primärantikörper mehrere Epitope besitzt, die von den markierten Sekundärantikörpern gebunden werden können [4]. Ein Nachteil dieses Ansatzes liegt in der Kreuzreaktivität der sekundären Antikörper, die zu starken, unspezifischen Hintergrundsignalen führen kann [5].
Sandwich-ELISA
Bei der sogenannten Sandwich-Methode wird das Antigen nicht direkt an den Untergrund gebunden. Stattdessen wird ein „Capture Antibody“ eingesetzt, welcher an der Mikrotiterplatte immobilisiert wird und das Antigen bindet. Ein weiterer, unmarkierter Detektionsantikörper bindet das Antigen an einer anderen Stelle, so dass es von zwei Antikörpern umgeben ist, das sogenannte „Sandwich“. Nun wird ein markierter, sekundärer Antikörper hinzugefügt, der an den zweiten Primärantikörper bindet und eine enzymatische Farbreaktion ermöglicht [5]. Durch die Verwendung zweier Antikörper für das Auffangen und Detektieren des Zielantigens, zeigt der Sandwich-ELISA sowohl eine hohe Sensitivität als auch Spezifität und ist daher die am häufigsten angewandte Variante des Assays.
Kompetitiver ELISA
Der kompetitive ELISA wird häufig angewandt, wenn das Antigen sehr klein ist oder nur ein Epitop besitzt. Bei dieser Methode wird markiertes Antigen eingesetzt, welches mit dem unmarkierten Antigen aus der zu untersuchenden Probe um die Bindungsstellen am Detektionsantikörper konkurriert [5]. Das Verhältnis zwischen der Konzentration des nachzuweisenden Antigens und der Signalstärke ist hier also umgekehrt proportional: Je geringer die Signalstärke, desto größer ist die Menge des gesuchten Proteins in der Probe [6]. In unserem Sortiment finden Sie unter anderem Acetylcholinesterase (AChE)-ELISAs von unserem Partner Cayman Chemical, welche ein bekanntes Beispiel für kompetitive ELISAs darstellen.
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Quellen
[1] E. Engvall & P. Perlmann. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9), 871-874 (1971).
[2] https://de.wikipedia.org/wiki/Enzyme-linked_Immunosorbent_Assay, 23.01.2023
[3] R. Yalow & S. Berson. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J. Clin. Invest. 39(7): 1157–1175 (1960).
[5] Alhajj M, Zubair M, Farhana A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay. StatPearls (2023) PMID: 32310382.