Übersicht der Multiplexen Immunhistochemie

Geschrieben von Dr. Jane Naberhuis

Für die Entwicklung von neuen Immuntherapien, ist es unumgänglich die Tumormikroumgebung zu erforschen. Immunhistochemie ist eine vielseitig einsetzbare Technik, um die Expression, Verteilung und Aktivierung von Proteinen in situ zu untersuchen. Zur Erkennung von Antigenen werden spezifische Antikörper auf dünnen Querschnitten aus schockgefrorenem oder Formaldehyd-fixiertem, paraffineingebettetem Gewebe eingesetzt. Die Visualisierung des Antigens wird durch enzymatische Reaktionen, die am Ort der Antikörper-Antigen-Bindung zur Präzipitation von Farbstoff führen, oder durch fluoreszierende Reporter ermöglicht. Fluoreszierende Reporter können entweder direkt an den primären Antikörper konjugiert werden (direkte Immunfluoreszenz) oder an einen sekundären Antikörper, der den Spezies-spezifischen primären Antikörper erkennt (indirekte Immunfluoreszenz). Die letzte Variante ist die häufiger angewandte Methode, da sie noch bei sehr geringen Antigen-Mengen Signale liefert.

In der Vergangenheit wurde diese Technik für jeden Immunmarker einzeln angewandt. In letzter Zeit hat sich die molekulare Histopathologie von Einzel-Marker Immunhistochemie hin zu Multiplex-Marker-Detektion entwickelt. Multiplex Immunhistochemie, auch mehrfach Immunlabeling oder Multiplex Immunostaining genannt, kann die aus einer einzelnen Probe gewonnene Datenmenge maximieren. Dies ist besonders wichtig in Fällen, bei denen die Probenmenge begrenzt ist, wie zum Beispiel bei einer Tumorbiopsie. Im Gegensatz zur Next Generation Sequenzierung oder Massenspektrometrie kann bei der Multiplex Immunhistochemie sowohl die räumliche Anordnung von Proteinen als auch Protein-Interaktionen und Co-Lokalisation untersucht werden. 

Chromogene Nachweise sind zwar prinzipiell mit Multiplex Immunhistochemie kompatibel, aber indirekte Labeling-Techniken mit Tyramid-basierter Fluoreszenz haben mehrere Vorteile. Durch die Ablagerung von Fluorophor-konjugiertem Tyramid an der Antigen-Bindungsstelle wird das Signal amplifiziert. Tyramid Signal Amplifikation (TSA) ermöglicht die Erkennung von sehr seltenen Targets in einer Probe und verbessert das Fluoreszenz-Signal. Außerdem ist wichtig, dass TSA auch die Verwendung von nicht-markierten primären Antikörpern erlaubt, mit der Flexibilität, mehrere Antikörper aus der selben Spezies einsetzen zu können.

Ein weiterer nicht unwichtiger Vorteil des Tyramid-basierten Fluoreszenz-Nachweises liegt in der Beständigkeit der Tyramid-Antigen Bindung, die durch die kovalente Bindung von Tyrosinresten am oder in der Nähe des Antigens stattfindet. Diese Beständigkeit erlaubt die Entfernung von Antikörpern mithilfe von Hitze, wobei das Fluoreszenzsignal des Antigens bestehen bleibt. Mit dieser Methode können verschiedene Antiköper aus der gleichen Wirtsspezies nacheinander angewendet werden ohne die sonst zu erwartende Kreuzreaktionen. Wenn zusätzlich unterschiedliche, nicht-überlappende Anregungs- und Emissionswellenlängen gewählt werden, ist es ein leichtes, verschiedene Zielproteine gleichzeitig zu visualisieren. Multispektral-Aufnahmen erlauben die grafische Isolierung von Fluorophoren mit partiell überlappenden Spektren und die Reduzierung von Gewebeautofluoreszenz.

Neuste Fortschritte in der Multiplex Immunhistochemie und der Multispektralbildgebung ermöglichen die genaue und gleichzeitige Analyse mehrerer Gewebsmarker. Bespielsweise kann die Analyse von Proliferations- und Autophagiemarkern im Darmgewebe bei der genauen Einschätzung des Epithel-Turnovers helfen. In der klinischen Anwendung kann die Aufklärung der Tumormikroumgebung und die Auswahl von Zielgerichteten Therapien durch das Lokalisieren und die Untersuchung von Immuncheckpoint-Proteinen verbessert werden. Die Anwendungen von Multiplex Immunhistochemie sind vielseitig und beinhalten klinische, translationale und Grundlagenforschung.

Detection of human CD3 (teal), CD8 (green), CD68 (orange), CK (red), Ki67 (yellow) and PD-L1 (white) in FFPE HNSCC by IHC-IF.

Nachweis von humanem CD3 (türkis), CD8 (grün), CD68 (orange), CK (rot), Ki67 (gelb) und PD-L1 (weiß) in FFPE HNSCC mit IHC-IF. Rabbit anti-CD3e recombinant monoclonal [BL-298-5D12], rabbit anti-CD8a recombinant monoclonal [BLR044F], mouse anti-CD68 monoclonal [KP-1], mouse anti-cytokeratin monoclonal [AE1/AE3], rabbit anti-Ki67 monoclonal [BLR021E] und rabbit anti-PD-L1 recombinant monoclonal [BLR020E]. Sekundärantikörper: HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG und HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. Substrat: Opal™ 480, 520, 570, 620, 690 und 780. Gegenfärbung: DAPI (blau).

Detection of human CD3 (yellow), CD8 (red), and CD20 (green) in FFPE tonsil by IHC-IF.

Nachweis von humanem CD3 (gelb), CD8 (rot), und CD20 (grün) in FFPE Mundel-Gewebe mit IHC-IF. Rabbit anti-CD3e recombinant monoclonal [BL-298-5D12], rabbit anti-CD8a recombinant monoclonal [BLR044F], mouse anti-CD20 monoclonal [L26]. Sekundärantikörper: HRP-conjugated goat antirabbit IgG und HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. Substrat: Opal™ 520, 620, und 690. Gegenfärbung: DAPI (blau).

Detection of human CD3 (yellow), CD20 (green), and CD68 (red) in FFPE lung carcinoma by IHC-IF.

Nachweis von humanem CD3 (gelb), CD20 (grün), und CD68 (rot) in FFPE Lungenkrebs-Gewebe mit IHC-IF. Rabbit anti-CD3e recombinant monoclonal [BL-298-5D12], mouse anti-CD20 monoclonal [L26], und mouse anti-CD68 monoclonal [KP-1]. Sekundärantikörper: HRP-conjugated goat antirabbit IgG und HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. Substrat: Opal™ 520, 620, und 690. Gegenfärbung: DAPI (blau).

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