Hilfe bei der Auswahl des richtigen Assays zur Messung von oxidativem Stress

Oxidativer Stress kann durch zwei Methoden bestimmt werden. Einmal durch die direkte Messung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder durch die indirekte Messung der Schädigungen von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren. Diese Schädigungen werden durch eine Überproduktion der ROS verursacht. Obwohl die direkte Messung von ROS genauer ist, werden die indirekten Methoden aufgrund der relativen Stabilität von Schadensmarkern an Biomolekülen öfters eingesetzt. In diesem Blog finden Sie eine Aufschlüsselung verschiedener Assays, die zum Nachweis der häufigsten Biomarker für oxidative Schäden verwendet werden.

ROS

Sauerstoff wird als Teil des normalen Stoffwechsels reduziert, was zur Bildung verschiedener ROS, darunter Wasserstoffperoxid (H2O2)  und Superoxid (O2•−) , führt. Schäden an zellulären Makromolekülen entstehen, wenn es zu unkontrollierten Oxidationen im biologischen System kommt. Assays für ROS erkennen nicht die Quelle der ROS-Produktion. Wenn das Versuchsmodell jedoch unter Stress steht, ist ein Anstieg der ROS und die Veränderung der molekularen Komponenten wahrscheinlich.

H2O2

H2Okann mit empfindlichen Sonden wie ADHP nachgewiesen werden, die an ein Enzym wie HRP gekoppelt sind. Die Assay-Spezifität wird signifikant verbessert, wenn ein H2O2 -Binder, wie z.B. eine Katalase, als Kontrolle einbezogen wird.1

Dihydroethidium

Dihydroethidium (Hydroethidin oder DHE) kann direkt in lebenden Zellen eingesetzt werden. Diese redoxempfindliche Sonde wird durch O2•− zur Bildung von 2-Hydroxyethidium (Ex: 500-530 nm, Em: 590-620 nm), oder durch unspezifische Oxidation durch H2O2, oder andere ROS-Quellen zur Bildung von Ethidium (Ex: 480 nm, Em: 576 nm) oxidiert.2,3

Xanthinoxidase

Xanthinoxidase (XO) produziert sowohl H2O2 als auch O2•−.1 Die Aktivität dieses Enzyms kann gemessen werden, indem das Nebenprodukt (H2O2) des Abbaus von Hypoxanthin durch XO über eine Sonde erfasst wird. 2,3

RNS

Reaktive Stickstoffspezies (RNS) entstehen ebenso bei oxidativem Stress. Hohe Mengen an Stickstoffmonoxid (NO), synthetisiert durch die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) und O2•− führen zur Bildung von Peroxynitrit. NO selbst reagiert mit Thiolen und Eisen-Schwefel-Enzymen, während Peroxynitrit mit Tyrosinresten zu Nitrotyrosin reagiert.4,5

Nitrat (NO3)/Nitrit (NO2)

NO3 und NO2  sind Produkte der in vivo NO-Reaktionen, deren Gesamtproduktion entweder mit Griess-Reagenzien oder DAN nachgewiesen werden kann.4,5 Diese Assays konvertieren zunächst NO3 zu NO2− unter Verwendung von NADPH-abhängiger Nitratreduktase. Mittels anschließender Reaktion mit Griess-Reagenzien oder DAN kann die Gesamtkonzentration von NO2-Ionen bestimmt werden..

NOS

Die NOS-Aktivität wird in Geweben und Zellen nachgewiesen. Dazu wird die von NOS angeregte Umwandlung eines radioaktiv markierten Arginins in Citrullin gemessen. Alternativ kann die in vitro NOS-Aktivität anhand der Griess-Reaktion nachgewiesen werden. Hierbei wird überschüssiges NADPH (zugegeben als Co-Faktor der NOS-Aktivität) mit einem Oxidationsschritt, katalysiert durch die Laktatdehydrogenase, entfernt.

DNA/RNA-Schäden

Guanin ist die Base, die am anfälligsten für Oxidation ist, wenn DNA und RNA beschädigt werden. Die Reparaturprozesse, die eingeleitet werden, um diesen Schaden zu beheben, setzen die folgenden oxidierten Guanin-Arten in den Urin frei:

  • 8-Hydroxyguanin — Eine ribose-freie Base
  • 8-Hydroxyguanosin — Ein Nukleosid aus der RNA
  • 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosin — Ein Deoxynukleosid aus der DNA

Assays, die DNA/RNA - Schäden nachweisen, können in zwei Kategorien eingeteilt werden. Zu der ersten Kateogorie gehören Assays, die mehrere oxidierte Guanin-Spezies nachweisen können. Sie erfassen einen vollständigeren Satz biologisch relevanter Produkte mit oxidativer Schädigung. Zu der zweiten Kategorie zählen Assays, die sich auf die Analyse von nur einem Molekül (z.B. 8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin) beschränken.6-9

Cayman-DNA-RNA-Damage

Abbildung 1: DNA/RNA-Schäden. . Beachten Sie, dass die O2 und ONOO- Moleküle beispielhafte ROS- und RNS-Spezies sind, die Schäden verursachen. Es gibt viele weitere Moleküle, die auch DNA und/oder RNA schädigen können . 

Proteinoxidation und Nitrierung

Der häufigste Marker für Proteinoxidation ist der Gehalt an Proteincarbonyl.10 Diese Kationen binden an Proteine und führen in Verbindung mit den ROS zur Bildung von Aminosäurederivaten mit Carbonylgruppen (Ketone, Aldehyde). Zigarettenrauch und Aldehyde führen u.a. auch zu Carbonylverbindungen in Proteinen. Alternativ erzeugt die ROS-Exposition an Methioninresten eines Proteins Proteinmethioninsulfoxid (MetO). Diese oxidative Modifikation wird, wenn nicht durch MetO-Reduktasen rückgängig gemacht, weiter zu Methioninsulfon oxidiert und kann zu Proteinfehlfunktionen führen. Das Vorhandensein von Nitrotyrosin auf Proteinen wird als Marker für Peroxynitrit verwendet, der in vivo gebildet wird, wenn NO  mit O2•− reagiert.12 Da Peroxynitrit eine heterolytische Spaltung erfährt, werden freie Nitroniumionen sowie Nitratprotein-Tyrosinreste gebildet. NO  kann Proteine durch S-Nitrosylation direkt modifizieren, wobei eine NO-Gruppe an Thiolgruppen von Cysteinresten bindet, was zur Bildung von S-NO führt.

Cayman-Protein-Damage

Abbildung 2: Proteinschäden. Beachten Sie, dass H2Ound OH nur beispielhaft für Proteinchädigende ROS-Spezies sind. Es gibt viele weitere Moleküle, die auch Proteine beschädigen können.

Carbonylgehalt

Eine geeignete Technik zum Nachweis des Carbonylgehalts in Proteinpräparaten ist die Reaktion zwischen DNPH und Proteincarbonyl. Dabei entsteht eine Schiff'sche Base, die ein entsprechendes Hydrazin erzeugt, das spektrophotometrisch gemessen werden kann.

Methioninsulfoxid (MetO)

Ein für MetO spezifischer Antikörper wird verwendet, um oxidative Modifikationen zu beobachten, indem Proteine mit MetO-Resten nachgewiesen werden.11

Nitrotyrosin

Ein für Nitrotyrosin spezifischer Antikörper wird zum Nachweis der Nitrierung verwendet.

S-Nitrosylierung

Die Protein-S-Nitrosylierung kann mit einem Biotin-Switch-Assay direkt visualisiert werden. Dieses Verfahren spaltet S-NO-Bindungen (nach dem Blockieren vorhandener freier Thiole), um die nun freien Thiolgruppen zu biotinylieren.13

Lipidperoxidation

Die Lipidperoxidation führt zur Bildung von hochreaktiven und instabilen Hydroperoxiden aus ungesättigten Lipiden. Sie können direkt oder indirekt durch die verschiedenen Zersetzungsprodukte (z.B. Alkane, Ketone, Aldehyde) von instabilen Hydroperoxiden gemessen werden. 8-Isoprostan, das durch zufällige Oxidation von Gewebephospholipiden hergestellt wird, gilt derzeit als einer der zuverlässigsten Biomarker für die Lipidperoxidation in vivo.14 Es ist ein spezifisches Produkt der Lipidperoxidation, das stabil ist und in allen normalen biologischen Flüssigkeiten und Geweben in nachweisbaren Mengen vorhanden ist. Der Grad der Veresterungen in Phospholipiden kann verwendet werden, um das Ausmaß der Lipidperoxidation an den gewünschten Zielstellen zu bestimmen. 

Cayman-Lipid-Damage

Abbildung 3: Lipischschaden. Beachten Sie, dass O2 und O2• − nur beispielhaft für Lipidschädigende ROS-Spezies sind. Es gibt viele weitere Moleküle, die auch Lipide beschädigen können.

Lipidhydroperoxide (LPOs)

LPOs können effizient extrahiert und direkt gemessen werden, indem Redoxreaktionen mit Eisenionen eingesetzt, um den gesamten Hydroperoxidgehalt zu einem bestimmten Zeitpunkt zu ermitteln.

4-Hydroxynonenal (4-HNE)

4-HNE-Proteinaddukte sind in der Regel stabiler als MDA-Proteinaddukte. 1,4-Dihydroxynonan-Mercaptursäure (DHN-MA), der wichtigste Harnstoffmetabolit von 4-HNE, ist ein zusätzlicher Biomarker, der gemessen werden kann.

Malondialdehyd (MDA)

MDA-Assays verwenden eine Thiobarbitur-Reaktion und werden daher Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) Assays genannt. Thiobarbitursäure reagiert mit verschiedenen Aldehyden, die bei der Lipidperoxidation zusätzlich zu MDA entstehen.15

8-lsoprostan

8-Isoprostan, das durch zufällige Oxidation von Gewebephospholipiden hergestellt wird, gilt derzeit als einer der zuverlässigsten Biomarker für die in vivo Lipidperoxidation.16 Es wird typischerweise entweder mit einem Immunassay oder LC-MS oder GC-MS analysiert.

Kit Empfehlungen

ROS Assays

Produkt Probentyp Was wird gemessen Methode
Hydrogen Peroxidas Cell-Based Assay Kit Kultivierte Zellen Extrazelluläres H2O2 Fluoreszenzmessung auf einer Platte (Ex: 530-560 nm, Em: 590 nm)
Mitochondrial ROS Detection Assay Kit Lebende Zellen Mitochondriale ROS Fluoreszenzmessung auf einer Platte (Ex: 480-515 nm, Em: 560-600 nm), oder Durchflusszytometrie
ROS Detection Cell-Based Kit (DHE) Lebende Zellen ROS Fluoreszenzmessung auf einer Platte (Ex: 480-520 nm, Em: 570-600 nm), oder Durchflusszytometrie 
Xanthine Oxidase Fluorometric Assay Kit Plasma, Serum und Gewebehomogenate XO Aktivität Fluoreszenzmessung auf einer Platte (Ex: 520-550 nm, Em: 585-595 nm), oder Durchflusszytometrie

RNS Assays

Produkt  Probentyp Was wird gemessen Methode
Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit Plasma, Serum, Urin, Gewebekulturmedien und Gewebehomogenate NO Metaboliten Farbmetrische Messung auf einer Platte (540-560 nm)
Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit (LDH method) Plasma, Serum, Urin  und Gewebehomogenate In vitro NOS Aktivität und NO• Metaboliten Farbmetrische Messung auf einer Platte (530-550 nm)
Nitrate/Nitrite Fluorometric Assay Kit Plasma, Serum, Urin, Gewebekulturmedien und Gewebehomogenate NO Metaboliten Fluoreszenzmessung auf einer Platte (Ex: 360-365 nm, Em: 430 nm)
NOS activity Assay Kit Zelllysate und aufgereinigte Präparate NOS Aktivität Flüssigzintillationszählung

DNA/RNA Damage Assays

Produkt  Probentyp Was wird gemessen Methode
DNA/RNA Oxidative Damage (Clone 7E6.9) ELISA Kit Urin (andere Poben wurden noch nicht validiert, können aber vielleicht genutzt werden) 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosin und 8-Hydroxyguanosin Farbmetrische Messung auf einer Platte (405-420 nm)
DNA/RNA Oxidative Damage (High Sensitivity) ELISA Kit Urine, Zellkulturmedium, Zelllysate, Gewebsproben, Speichel, Plasma oder Serum Proben 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosin, 8-Hydroxyguanosin and 8-Hydroxyguanine Farbmetrische Messung auf einer Platte  (405-420 nm)

Protein Oxidation and Nitration Assays

Produkt Probentyp Was wird gemessen Methode
Protein Carbonyl Colorimetric Assay Kit Plasma, Serum, Urin, Gewebehomogenate und Zelllysate Protein-Carbonylgehalt Farbmetrische Messung auf einer Platte (360-385 nm)
Methionine Sulfoxide Immunoblotting Kit Plasma, CSF, Zell/Gewebs-Lysate oder semi-reine/aufgereinigte Proteine Proteine die MetO-Reste beinhalten Immunochemische Detektion mittels Westernblot
Nitrotyrosine IP Kit Zelllysate Nitrierter Tyrosingehalt Affinität-Sorbens-Erfassung und Elution mittels Westernblot oder Proteomanalysen
S-Nitrosylated Protein Detection Kit (Biotin Switch) Ganze Zellen oder Gewebe S-NO Proteine Streptavidin-basierte Detektion mittels Westernblot oder Fluoreszenzmikroskopie
S-Glutathionylated Protein Detection Kit Ganze (permeabilisierte) Zellen Protein-PSSG adukte Streptavidin-basierte Detektion mittels Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie, oder IP/Avidin-Überlappungsanalyse

Lipid Peroxidation

Produkt  Probentyp Was wird gemessen Methode
DHN-MA EIA Kit Urin DHN-MA, a 4-HNE Metabolite Farbmetrische Messung auf einer Platte (405-414 nm)
8-Isoprostane ELISA Kit Plasma, Serum, Urin, Lavageflüssigkeiten, Gewebehomogenate und Kulturmedium  8-Isoprostan Farbmetrische Messung auf einer Platte (405-420 nm)
8-Isoprostane Express ELISA Kit Plasma, Serum, Urin, Lavageflüssigkeiten, Gewebehomogenate und Kulturmedium  8-Isoprostan Farbmetrische Messung auf einer Platte (405-420 nm)
STAT-8-Isoprostane ELISA Kit Plasma, Serum, Urin, Lavageflüssigkeiten, Gewebehomogenate und Kulturmedium  8-Isoprostan Farbmetrische Messung auf einer Platte (405-420 nm)
Liquid hydroperoxide (LPO) Assay Kit Gewebe, kultivierte Zellen, Pflanzenmaterial, Nahrung und biologische Flüssigkeiten LPOs Farbmetrische Messung auf einer Platte (500 nm)
Liquid hydroperoxide (LPO) Assay Kit (96 well) Gewebe, kultivierte Zellen, Pflanzenmaterial, Nahrung und biologische Flüssigkeiten LPOs Farbmetrische Messung auf einer Platte (500 nm)
TBARS Assay Kit Plasma, Serum, Urin,  Gewebehomogenate und Zelllysate   MDA-TBA Addukt Farbmetrische Messung auf einer Platte (530-540 nm) oder Fluoreszenzmessung (ex 530 nm, em 550 nm)
TBARS (TCA Method) Assay Kit Plasma, Serum, Urin,  Gewebehomogenate und Zelllysate   MDA-TBA Addukt Farbmetrische Messung auf einer Platte (530-540 nm) oder Fluoreszenzmessung (Ex: 530 nm, Em: 550 nm)

Referenzen

  1. Kelley, E.E., Khoo, N.K., Hundley, N.J., et al. Free Radic. Biol. Med. 48(4), 493-498 (2010).
  2. Michalski, R., Michalowski, B., Sikora, A., et al. Free Redic. Biol. Med. 67, 278-284 (2014).
  3. Zhao, H., Kalivendi, S., Zhang, H., et al. Free Radic. Biol. Med.34(11), 1359-1368 (2003).
  4. Green, L.C. Wagner, D.A., Glogowski, J., et al. Anal. Biochem.126, 131-138 (1982).
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  7. Shi, F., Nie, B., Gan, W., et al. Free Radic. Res.46(9), 1093-1098 (2012).
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  10. Stadtman, E.R. and Oliver, C.N. J. Biol. Chem.266(40), 2005-2008 (1991).
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  13. Jaffrey, S.R. and Snyder, S.H. Sci STKE2001(86), pl1 (2001).
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  16. Roberts, L.J. and Morrow, J.D. Free Radic. Biol. Med.28, 505–513 (2000).

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