Proximity Ligation: Eine revolutionäre Technologie zum Nachweis von Proteinen

Zelluläre Prozesse können nur als das dynamische Zusammenspiel von Molekülen verstanden werden. Das bedeutet, dass wir präzise Techniken benötigen, um die Interaktionen endogener Proteine direkt in einzelnen Zellen und Geweben zu beobachten. So können wir die zelluläre und molekulare Architektur und ihre Reaktionen auf Störfaktoren analysieren.

Die Erfindung der Proximity Ligation Technologie

Die Suche nach Detektionsmethoden mit höherer Empfindlichkeit und Spezifität ist ein ständiger Begleiter in Forschungsbereichen, die mit Proteinen zu tun haben. Außerdem wir stets nach Möglichkeiten gesucht, um zu erforschen, wie Proteine miteinander interagieren und wie sie in ihrer natürlichen Gewebe-Mikroumgebung modifiziert und exprimiert werden. Die Forschungsgruppe von Ulf Landegren in der Abteilung für Immunologie, Genetik und Pathologie der Universität Uppsala entschied daher, eine Methode zu entwickeln, die eine Lösung für diese wachsenden Anforderungen in der Proteomik bieten könnte. In einer bahnbrechenden Arbeit von Simon Fredriksson et al. aus dem Jahr 2002 wurde die als Proximity Ligation bezeichnete Technologie erstmals beschrieben. Darin zeigten die Autoren, dass eine hochspezifische und sensitive Proteindetektion erreicht werden kann, indem zwei DNA-Aptamer-Sonden mit Sequenzerweiterungen ergänzt werden, die durch Ligation verbunden werden können. Auf diese Weise können Sonden, die das gleiche Zielmolekül erkennen und somit in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander liegen, verbunden und mittels empfindlicher Echtzeit-PCR-Amplifikation detektiert werden. In späteren Arbeiten der Gruppe wurden die Aptamere durch Oligonukleotid-konjugierte Antikörper ersetzt, die als Proximity-Sonden dienen. Die Anwendung von Proximity-Assays für den Nachweis von Proteinen in Lösung entwickelte sich zu Proximity-Extension-Assays, die als hochleistungsfähige Multiplex-Assays von Olink Proteomics kommerzialisiert wurden, die 2016 aus Olink Bioscience hervorgegangen war.

in situ Proximity Ligation

Ola Södergren et al. beschrieb erstmals 2006 die Anwendung der in situ Proximity Ligation Technologie zur Lokalisierung von Proteinen. Die Autoren nutzten die Methode zur Visualisierung von Proteinen und deren Interaktionen in fixierten Zellen und Geweben, indem sie die Proximity Ligation mit der Rolling Circle Amplification (RCA) kombinierten. Die zirkularisierten DNA-Stränge bleiben mit den Proximity-Sonden hybridisiert. Ein Oligonukleotid dient im darauf folgenden Schritt als Primer für eine lokale RCA-Reaktion. Die amplifizierte DNA kann dann durch entsprechend markierte Detektionssonden als hell fluoreszierender Spot visualisiert werden.

Die Publikation demonstrierte den Vorteil der Proximity Ligation Technologie, die intra- und interzelluläre Verteilung endogener Proteine auf Einzelmolekülebene zu erfassen. Dies ist von großem Nutzen bei der Untersuchung biologischer Prozesse wie der Regulation von Proliferation, Differenzierung und dem Überleben in komplexen Mikroumgebungen, beispielsweise in Tumoren. Da die Proben vor der Analyse fixiert werden, liefert die Technologie Schnappschüsse von zellulären Prozessen, einschließlich stabiler und transienter Interaktionen, mit Einzelzell- und subzellulärer Auflösung innerhalb der ungestörten Mikroumgebung. Die patentierte in situ Proximity Ligation Technologie wurde unter dem Namen Duolink von der Firma Olink Biosciences vermarktet und in über 7500 Publikationen weltweit beschrieben. Die Duolink-Produktlinie wurde 2016 an Sigma Aldrich lizenziert.

UnFold in situ Proximity-Sonden

Im Jahr 2018 veröffentlichten Axel Klaesson et al. eine Arbeit, die ein neues Proximity-Sondendesign namens UnFold beschreibt. Die UnFold-Technik unterscheidet sich von der früheren Version der in situ PLA-Technik dadurch, dass alle für die amplifizierte Detektion erforderlichen DNA-Elemente in den mit den Antikörpern konjugierten Oligonukleotiden enthalten sind.

Im Vergleich zum konventionellen in situ PLA-Sondendesign verbessern die UnFold in situ Proximity-Sonden die Effizienz der Signalerzeugung: Das Oligonukleotid, das den Kreis bildet, ist bereits auf einer der Sonden vorhanden. Es ist zudem nur eine Ligationsreaktion erforderlich, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sich Kreise bilden, die als Vorlage für RCA dienen können. Die UnFold-Technik wird unter der Marke NaveniTMFlex von Navinci, dem neuen Namen von Olink Biosciences, vermarktet.

Die in situ Proximity Ligation wird zur Verbesserung der Sensitivität und Spezifität bereits in vielen Methoden zur Proteinlokalisierung eingesetzt. Dazu zählen die Mikroskopie, Western Blotting, Durchflusszytometrie und Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA). Die Technologie ist so positioniert, dass sie eine integrale Rolle in der räumlichen biologischen Forschung und in klinischen Anwendungen spielen wird. Sie dient der leistungsstarken Proteindetektion in situ und der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und posttranslationalen Modifikationen direkt in einer intakten Gewebemikroumgebung.

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