Die Top 10 der DNA-Farbstoffe und Sonden

Mit über 50 verschiedenen Reagenzien und Sonden zur Detektion von DNA kann die Auswahl des optimalen Farbstoffes durchaus schwer fallen. Unser Partner AAT Bioquest hat daher eine Liste der zehn besten DNA-Farbstoffe und Sonden für Sie zusammengestellt.

Ethidiumbromid

• günstig
• möglicherweise kanzerogen
• gut etabliert
• nicht membrangängig
• Gelelektrophorese
• Fluoreszenzmikroskopie
• orange Fluoreszenz

Ethidiumbromid (EtBr) ist der wohl erfolgreichste und verbreitetste DNA-Farbstoff. Schon in den 1950er Jahren wurde EtBr zur Behandlung parasitärer Erkrankungen in Nutztieren eingesetzt und war somit leicht kommerziell erhältlich. Ab den 70er Jahren wurde Ethidiumbromid im Laborbetrieb eingesetzt und gehörte somit zu den ersten DNA-Farbstoffen. Der Erfolg von Ethidiumbromid liegt aber nicht nur in seinem Startvorteil begründet sondern auch in seinem geringeren Preis. Selbst in großen Mengen bleibt es bezahlbar: Ein Gramm kostet etwa 30 €. Je nach Anbieter und Packungsgröße können die Preise aber auch deutlich darunter oder darüber liegen. Ethidiumbromid eignet sich hervorragend zur Färbung von DNA in Agarose- und PAA-Gelen. Es kann zudem zum Nachweis von dsDNA bei PCRs genutzt werden. Ethidiumbromid zeigt bei Anregung mit UV-Licht (~300 nm) ein charakteristisches oranges Fluoreszenzsignal mit einer Wellenlänge von 605 nm. Nach Bindung an die DNA - es interkaliert zwischen zwei aufeinander folgenden Basenpaaren - erhöht sich die Helligkeit dieses Signals um das Zwanzigfache. Je nach Struktur, kann daher auch RNA mit EtBr nachgewiesen werden. Es eignet sich allerdings nicht zur DNA-Färbung in lebenden Zellen, da es die Zellmembran nicht durchdringen kann. Über die Jahre wurde die Nutzung von Ethidiumbromid im Laboralltag immer wieder Anlass gesundheitlicher Bedenken. Die Befürchtung ist, dass EtBr dank seiner interkalierenden Eigenschaften mit der DNA-Replikation und Transkription interferiert und daher als Mutagen wirkt. Bisher gibt es aber zumindest in Säugetieren keine Studie, die eine mutagene/kanzerogene Wirkung von Ethidiumbromid nachweist.

Propidium Iodide

• Durchflusszytometrie
• Multiplexing
• rote Fluoreszenz
• 488 nm Argonlaser
• Viabilitätsmessung
• nicht membrangängig

Propidiumiodid ist ein DNA-bindender Fluoreszenzfarbstoff aus der gleichen chemischen Familie wie Ethidiumbromid. Folglich besteht das Molekül ebenfalls aus einer stickstoffhaltigen Grundstruktur. Der Hauptunterschied ist das quaternäre Amin, das das Iodidion bindet. Nach DNA-Bindung verstärkt sich die Fluoreszenz um den Faktor 20-30. Der Effekt ist ähnlich bei einer Bindung an RNA, sofern die RNA gefaltet vorliegt. Genau wie Ethidiumbromid ist auch Propidiumiodid nicht membrangängig, es kann aber durch beschädigte Membranen in die Zellen eindringen und ermöglicht so die Detektion toter Zellen. Es wird auch zur Quantifizierung des DNA-Gehalts in biologischen Proben verwendet. Propidiumiodid hat keine Sequenzpräferenz und bindet etwa alle 4-5 Basenpaare. Zur Anregung eignen sich Xenon- oder Quecksilberlampen, sowie 488 nm Argonlaser. Dank seiner Emissionswellenlänge von 617 nm wird Propidiumiodid gerne in Multiplex-Assays genutzt, kann leicht mit anderen Fluorophoren wie Fluorescein kombiniert werden und dient als Gegenfärbung bei Mehrfarbenanalysen. Der Preis liegt deutlich über dem von Ethidiumbromid (knapp 1000 $ pro Gramm).

Kristallviolet

• Gram-Färbung
• Gelelektrophorese
• nicht-fluoreszent
• geringe Sensitivität
• günstig
• ungiftig

Kristallviolett ist ein relativ einfach aufgebautes Molekül aus drei zentral verknüpften Benzolringen, an denen jeweils ein Amin gebunden ist. Seit dem späten 19. Jahrhundert befindet es sich in medizinischer Verwendung: als antibakterielles und antiseptisches Agens aber vor allem als Färbereagenz in der Histologie und Bakteriologie. Die meisten werden daher durch die Gram-Färbung mit Kristallviolett in Kontakt gekommen sein. In seiner Funktion als DNA-Farbstoff kann es auch zur Färbung von Nukleinsäuren nach einer Gelelektrophorese genutzt werden. Der Hauptvorteil von Kristallviolett gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen wie beispielsweise Ethidiumbromid ist hierbei, dass kein UV-Licht zur Anregung eines Fluorophors benötigt wird und folglich auch keine UV-bedingte DNA-Degradation auftritt. Dieser Vorteil wird allerdings mit einem Verlust an Sensitivität erkauft. Während mit Ethidiumbromid unter guten Bedingungen 1 ng DNA pro Bande nachgewiesen werden kann, liegt die Sensitivität von Kristallviolett bei etwa 16 ng. Durch Gegenfärbung, z.B. mit Methyl-Orange, lässt sich zwar dieser Wert auf bis zu 8 ng pro Bande verringern, doch die Sensitivität von EtBr lässt sich auch so nicht erreichen.

dUTP-konjugierte Sonden

• vielseitig
• direktes Labeling
• Hybridisierung
• PCR
• FISH
• DIG-dUTP

dUTP-konjugierte Sonden sind eine ganz eigene und interessante Klasse an DNA-Detektoren, vor allem durch die experimentelle Flexibilität, die sie einem bieten. Die Grundidee ist einfach: Mittels eines Linkers wird ein Konjugat (z.B. ein Farbstoff oder Biotin) an dUTP gekoppelt und zu den Zellen gegeben. Bei der Synthese neuer DNA wird das dUTP in die DNA mit eingebaut, womit nun auch das Konjugat Teil des Makromoleküls ist. Da diese Konjugation mit dUTP mit vielen verschiedenen Molekülen möglich ist, eignen sich dUTP Sonden für verschiedenste Anwendungen, in denen sie vielfältig verwendet werden: Beispiele sind PCR-Monitoring sowie FISH-Techniken. Die häufigsten dUTP-Konjugate sind hierbei Digoxigenin, Biotin und Fluorescein. Alle drei ermöglichen die Herstellung nicht-radioaktiver DNA-Sonden und werden besonders häufig in Immunoassays (ELISA) verwendet.

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)

• blaue Fluoreszenz
• A-T präferierend
• Fluoreszenzmikroskopie
• etwas membrangängig
• zellschädigend
• ungiftig
• Multiplexing

DAPI wurde, wie viele andere Farbstoffe in dieser Liste, zunächst als Arzneistoff verwendet und bei der Behandlung der Trypanomiasis (Schlafkrankheit, Chagas, Nagana) eingesetzt. In den späten 70er Jahren wurde das Potential von DAPI als DNA-Farbstoff erkannt und ist seitdem aus der Fluoreszenzmikroskopie nicht mehr wegzudenken. Es bindet besonders stark an AT-reichen Regionen des Doppelstrangs und in der Folge verstärkt sich die Fluoreszenz um das Zwanzigfache. DAPI bindet auch an RNA, allerdings verschiebt sich die Fluoreszenz dann in Richtung rot und die Fluoreszenzerhöhung fällt geringer aus. In der Fluoreszenzmikroskopie wird es vor allem zur Färbung toter Zellen oder Zellen mit geschädigter Zellmembran eingesetzt. Zwar ist DAPI zumindest etwas membrangängig, kann also, wenn auch langsam, auch intakte Zellmembranen durchdringen, doch zur Färbung intakter Zellen ist es wenig geeignet. Die Anregungswellenlänge von DAPI ist 358 nm und die Emissionswellenlänge liegt bei 461 nm, es erscheint also blau. DAPI ist äußerst zytotoxisch - ein weiterer Grund es nicht zur Färbung lebender Zellen zu verwenden. Für Menschen scheint es aber nur wenig giftig zu sein. Wie die meisten DNA-bindenden Chemikalien steht es aber unter Verdacht, mutagen zu wirken.

7-AAD (7-aminoactinomycin D)

• G-C präferierend
• Multiplexing
• rote Fluoreszenz
• 543 nm Helium-Laser
• Viabilitätsmessung
• nicht membrangängig
• Fluoreszenzmikroskopie
• Durchflusszytometrie

7-AAD ist ein interkalierender Fluoreszenzfarbstoff. Genau wie DAPI ist auch 7-AAD hochaffin für doppelsträngige DNA, doch anders als DAPI bindet 7-AAD nicht präferiert an AT-reichen sondern an GC-reichen Regionen der DNA. Es bindet auch RNA, sodass in bestimmten Anwendungen ein RNA-Verdau vor der Färbung zu empfehlen ist. Die Anregung von 7-AAD erfolgt bei 546 nm und das Fluoreszenzsignal hat sein Maximum bei einer Wellenlänge von 647 nm. Aufgrund der außergewöhnlich hohen Stokes-Verschiebung eignet sich 7-AAD besonders in Kombination mit blauen und grünen Fluoreszenzfarbstoffen bei multiparametrischer Durchflusszytometrie und anderen Fluoreszenz-basierten Methoden. 7-AAD lässt sich ausgezeichnet mit einem 543 nm Helium-Laser anregen. Wie viele andere Farbstoffe in dieser Liste ist auch 7-AAD nicht membrangängig und eignet sich daher gut für die Detektion toter Zellen. Intakte Zellen lassen sich aber nur schwer anfärben.

Hoechst 33258 (33342, 34580)

• blaue Fluoreszenz
• Nachweis lebender Zellen
• membrangängig
• geringe Zytotoxizität
• A-T präferierend
• Xenon-Quecksilber Lampen
• UV-Laser
• Fluoreszenzmikroskopie
• Durchflusszytometrie

Hoechst Farbstoffe sind eine Gruppe blau-fluoreszierender, chemisch nah verwandter Moleküle, die seit Ende der 70er Jahre zur Färbung von DNA verwendet werden. Entwickelt von der deutschen Hoechst AG sind sie eine gute Alternative zu traditionellen blauen Fluoreszenzfarbstoffen. Anders als vergleichbare Farbstoffe, wie beispielsweise DAPI, können Hoechst-Farbstoffe leicht auch in intakte Zellen eindringen, wodurch sie, insbesondere Hoechst 33258, auch ausgesprochen gut für die Färbung toter und lebender Zellen geeignet sind. Zudem zeichnen sich Hoechst-Farbstoffe durch ihre relativ geringe Zytotoxizität aus und haben einen recht geringen Einfluss auf die Zellpopulationen. Hoechst-Reagenzien binden selektiv in der kleinen Furche der AT-reichen Regionen doppelsträngiger DNA. Nach DNA-Bindung verstärkt sich die Fluoreszenz um das etwa Dreißigfache. Hoechst-Farbstoffe werden durch UV-Licht mit einer Wellenlänge von ~360 nm angeregt und emittieren blaues Licht von etwa 460 nm. Praktikable UV-Quellen zur Anregung sind daher Xenon-Quecksilber Lampen und UV-Laser. Typische Anwendungen für Hoechst-Farbstoffe sind Fluoreszenzmikroskopie, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie. Es ist wichtig, die Unterschiede zwischen Hoechst 33258, 33342 und 34580 zu beachten: Hoechst 33342 ist dank der Addition einer lipophilen Ethylgruppe deutlich membrangängiger als Hoechst 33258. Das Emissionsspektrum von 34580 ist im Vergleich zu Hoechst 33258 und Hoechst 33342 leicht blauverschoben und liegt daher bei 437 nm statt 461nm.

PicoGreen®/Helixyte™

• teuer
• extrem sensitiv
• grüne Fluoreszenz
• PCR
• Mikroplatten
• dsDNA

PicoGreen (und sein chemisches Äquivalent Helyxit) ist äußerst sensitiv für doppelsträngige DNA und wird in biochemischen Verfahren wie der Quantifizierung von DNA in Mikroplatten verwendet. Es kann hierbei dsDNA in einer Konzentrationen von 25 ng/mL nachweisen, wodurch es deutlich sensitiver als die Hoechst-Farbstoffe ist. Zu seiner Sensitivität kommt hinzu, dass PicoGreen® äußerst selektiv an dsDNA bindet. Wie der Name sagt, emittiert PicoGreen® im grünen Bereich des Spektrums, wobei sich die Fluoreszenz um den Faktor 1000 erhöht, wenn das Molekül DNA bindet. Daraus ergibt sich auch das sehr gute Signal-Rausch-Verhältnis, dass man bei der Verwendung von PicoGreen® bei PCRs oder Micro-Arrays erwarten kann. Es fungiert als guter Ersatz für DAPI oder Hoechst, insbesondere wenn man nur geringe Mengen DNA nachweisen möchte. Die deutlich höhere Sensitivität und Selektivität muss einem der Preis aber auch Wert sein, der Milliliter kostet mehrere hundert Euro.

YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1

• teuer
• extrem sensitiv
• nicht membrangängig
• Durchflusszytometrie
• Viabilitätsmessung
• Cyanine
• grüne Fluoreszenz

Diese Gruppe von Cyaninfarbstoffen basieren alle auf dem gemeinsamen Vorläufermolekül Oxazol-Gelb. Trotz dieses Namens fluoreszieren diese Farbstoffe eher im grünen als im gelben Bereich. Beispiele hierfür sind YOYO-1/DiYO-1 mit einem Emissionsmaximum bei 509 nm und TOTO-1/DiTO 1 mit einem bei 535 nm Wellenlänge. Auch diese Farbstoffe interkalieren, das heißt sie platzieren sich zwischen die planaren Oberflächen der DNA-Basen. Besonderes Kennzeichen dieser Farbstofffamilie ist ihre enorme Affinität zu DNA: Nach Bindung verstärkt sich das Fluoreszenzsignal um das ein- bis dreitausendfache. Das macht sie natürlich besonders geeignet für Experimente, die eine sehr große Sensitivität benötigen. Sie kosten dafür aber auch bis zu mehreren tausend Euro pro Milliliter (mL). YOYO-1 und TOTO-1 sind beide nicht membrangängig und können daher nicht in das Zytoplasma lebender Zellen gelangen. Für die Anfärbung fixierter oder toter Zellen eignen sie sich aber sehr gut und werden daher in Zellviabilitäts- und Zytotoxizitäts-Assays verwendet.

SYBR®

• grüne Fluoreszenz
• qPCR
• Gelelektrophorese
• teuer
• Cyanin

SYBR ist eine Familie Cyanin-basierter Farbstoffe die sowohl RNA als auch DNA binden. SYBR-Farbstoffe haben eine hohe Selektivität für doppelsträngige DNA, binden aber auch einzelsträngige DNA und RNA. Sie sind meistens grün fluoreszierend (SYBR Green I and SYBR Green II), es gibt aber auch gelbe Varianten (SYBR Gold). SYBR-Farbstoffe werden primär zur Quantifizierung von dsDNA eingesetzt, zum Beispiel bei quantitativer real-time PCR (qPCR) oder bei der Auswertung von Gelen. SYBR wurde als sicherer Nachfolger von Ethidiumbromid verkauft, allerdings ist nicht eindeutig belegt, dass SYBR-Farbstoffe tatsächlich weniger gefährlich sind. Mit Bezug zum Preis kann SYBR aber nicht mit der Konkurrenz in Form von Ethidiumbromid mithalten: ein Milliliter kostet etwa 500 €.

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